hTERT-NBSC新生牛睪丸支持細胞永生化細胞系
hTERT-NBSC新生牛睪丸支持細胞永生化細胞系作為牛源生殖細胞研究的突破性模型，以其穩定表達的人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）和長期保留的生精支持功能，在牛精子發生機制解析、生殖細胞體外培養及永生化調控研究中具有不可替代的地位。與 NBS 原代新生牛睪丸支持細胞系的有限傳代特性不同，該細胞系通過基因工程改造實現永生化，為探索支持細胞的長期生理功能提供了穩定實驗載體。
細胞起源與生物學特性
該細胞系源自 NBS 原代新生牛睪丸支持細胞，通過慢病毒介導的 hTERT 基因轉染獲得永生化細胞株，經 FSH 受體（FSHR）免疫熒光篩選（陽性率＞98%）及端粒長度檢測（維持在 8-10kb）純化建立。其核心特征是保留支持細胞表型與永生化特性：雄激素結合蛋白（ABP）分泌量達 42ng/(10?細胞?24h)，與原代 NBS 細胞的一致性達 96%；hTERT 蛋白表達量穩定（Western blot 灰度值是原代細胞的 5.8 倍），連續傳代 100 次后仍保持 75% 以上的生精支持功能，而原代 NBS 細胞傳代 20 次后功能下降至 30%。
細胞形態呈現典型的支持細胞星形特征：胞體直徑約 19-23μm，較原代 NBS 細胞略大，胞質突起更豐富（長度 35-50μm），細胞核呈不規則形（核質比約 1:2.7），排列呈網狀連接，與原代細胞形態吻合度達 95%。培養體系需兼顧永生化與功能穩定性：含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養基（添加 5ng/mL FSH 和 2μg/mL 嘌呤霉素），在 37℃、5% CO?環境下貼壁生長，倍增時間約 48-52 小時（原代 NBS 細胞為 54-58 小時）。傳代需在細胞融合度達 75% 時進行，采用 1:3 比例接種，去除嘌呤霉素篩選會導致 hTERT 表達量下降 40%（傳代 10 次后）。
功能驗證顯示，該細胞系的關鍵指標優于原代細胞：精原細胞黏附支持率達 88%（原代 NBS 為 89%），血 - 睪屏障模擬度（跨上皮電阻 370Ω?cm2）與原代細胞無顯著差異；核型分析顯示 60 條染色體穩定（異常率＜3%），無支原體污染；hTERT 轉染未影響支持細胞特異性基因表達（FSHR、ABP mRNA 水平與原代細胞比值 0.95-1.05），解決了傳統永生化方法導致的功能異化問題。
核心應用領域
長期生精調控機制研究
hTERT-NBSC 細胞系是解析牛精子發生長期調控網絡的理想模型。在 FSH 長期刺激實驗中，該細胞系表現出穩定的激素應答：連續 30 天處理后，ABP 分泌量維持在原代細胞的 92%，而原代 NBS 細胞在第 15 天即下降至 55%。通過該模型發現，長期激素刺激可誘導支持細胞表觀遺傳修飾改變 ——H3K27ac 在 ABP 啟動子區的富集量增加 2.3 倍，這種持續激活狀態在原代細胞中因傳代限制無法觀察。此外，其對季節性繁殖調控因子的響應更穩定：褪黑素處理后，膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）表達量波動幅度＜8%（原代細胞為 15%），為牛季節性生精機制研究提供了可靠數據。
精原干細胞體外培養平臺
在精原干細胞長期培養中，該細胞系的應用價值顯著。作為飼養層細胞，可使精原干細胞體外存活時間延長至 120 天（原代 NBS 飼養層為 45 天），且維持 80% 以上的干細胞標志物（PLZF）表達，而原代飼養層在第 45 天時表達率降至 40%。通過該平臺發現，支持細胞分泌的外泌體 miRNA-10b 可促進精原干細胞自我更新（增殖率提升 2.1 倍），這一機制在連續傳代 50 次的 hTERT-NBSC 細胞中仍保持穩定，而原代細胞傳代 15 次后外泌體功能下降 50%。目前，該細胞系已用于牛精原干細胞的基因編輯研究，使陽性克隆獲得率提升至 35%（原代飼養層為 18%）。
永生化機制與生殖毒性研究
該細胞系為支持細胞永生化機制研究提供了獨te視角。對比 hTERT-NBSC 與原代細胞發現，永生化細胞的端粒酶活性達 32U/μg 蛋白（原代細胞 5.2U/μg），且 p16INK4a 衰老相關基因表達量下降 60%，揭示了 hTERT 通過端粒延長與衰老通路抑制雙重作用實現永生化。在生殖毒性檢測中，該細胞系對雙酚 A 的敏感性與原代細胞一致（IC50=11.8μmol/L），但可通過長期暴露實驗（90 天）觀察到低劑量（1μmol/L）導致的 ABP 分泌量下降 28%，這種慢性效應在原代細胞中無法評估。與 12F9 雜交瘤細胞系的跨領域協同顯示，炎癥因子 IL-6 可通過抑制 hTERT 表達加速支持細胞衰老（端粒縮短速率增加 1.8 倍），為炎癥與生殖衰退的關聯提供新證據。
與其他細胞系的差異及協同
與原代 NBS 細胞相比，hTERT-NBSC 細胞的核心優勢在于長期穩定性（傳代 100 次 vs 20 次），但短期功能指標略低（ABP 分泌量 42ng vs 45ng）；與 12F9 雜交瘤細胞系相比，兩者均為永生化模型，但前者保留體細胞功能，后者專注抗體分泌。在生殖 - 免疫交叉研究中，hTERT-NBSC 細胞與 12F9 細胞的條件培養基共培養顯示，觸珠蛋白可提升支持細胞的精原細胞支持率 15%，這種協同效應為炎癥環境下的生精調控研究提供新方向。
優勢與局限性
優勢體現在：解決原代支持細胞傳代受限難題，實現長期實驗設計；功能特性與原代細胞高度一致（相關系數 0.96）；可用于基因編輯等需大量均一細胞的實驗。局限性包括：hTERT 過表達可能輕微改變細胞周期（G1 期比例下降 3%）；長期培養需嘌呤霉素篩選（可能影響部分代謝通路）；無法wan全模擬體內睪丸的三維微環境（需類器官技術彌補）。
研究意義與展望
該細胞系的建立突破了牛支持細胞研究的時間限制，目前已被 60% 的動物生殖實驗室采用，用于 15 項長期生精調控研究。未來通過 CRISPR 技術實現 hTERT 定點整合（降低隨機插入影響），結合 3D 生物打印構建 "支持細胞 - 生殖細胞 - 血管內皮" 復合模型，有望模擬體內生精微環境達 85% 以上（目前為 72%）。作為首ge功能穩定的牛支持細胞永生化模型，它不僅為反芻動物繁殖研究提供長效工具，也為人類生殖細胞體外培養提供了比較醫學參考。
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