hTERT-LSC羔羊睪丸支持細(xì)胞永生化細(xì)胞系
hTERT-LSC羔羊睪丸支持細(xì)胞永生化細(xì)胞系作為通過(guò)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）介導(dǎo)永生化的特異性細(xì)胞模型，在反芻動(dòng)物生殖發(fā)育機(jī)制、細(xì)胞永生化調(diào)控及雄性生殖疾病研究領(lǐng)域具有里程碑式的價(jià)值。它的建立突破了原代支持細(xì)胞傳代有限的瓶頸，為長(zhǎng)期追蹤羔羊睪丸支持細(xì)胞的分化規(guī)律、生精微環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持及永生化相關(guān)信號(hào)通路研究提供了穩(wěn)定的體外平臺(tái)，對(duì)揭示反芻動(dòng)物生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞互作機(jī)制及繁育技術(shù)創(chuàng)新意義深遠(yuǎn)。
睪丸支持細(xì)胞的體外研究長(zhǎng)期受限于原代細(xì)胞傳代次數(shù)少（通常不超過(guò) 15 代）、增殖能力隨傳代逐漸衰退等問(wèn)題，難以開(kāi)展長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定的功能驗(yàn)證。hTERT 作為調(diào)控端粒長(zhǎng)度的關(guān)鍵因子，通過(guò)導(dǎo)入該基因可使細(xì)胞突破增殖極限，實(shí)現(xiàn)永生化同時(shí)保留原有生物學(xué)特性。羔羊階段的支持細(xì)胞處于增殖分化關(guān)鍵期，其永生化細(xì)胞系的建立不僅解決了材料獲取的局限性，更能精準(zhǔn)模擬青春期前睪丸支持細(xì)胞的生理狀態(tài)，為解析反芻動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育的時(shí)間依賴性規(guī)律提供了獨(dú)te工具。
hTERT-LSC 細(xì)胞系的建立采用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕蚓庉嬇c細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的方案。從健康新生羔羊睪丸組織中分離原代支持細(xì)胞，通過(guò)免疫磁珠分選（利用 CD90 特異性標(biāo)志物）獲得高純度細(xì)胞群。采用慢病毒載體將 hTERT 基因?qū)朐?xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株。陽(yáng)性克隆接種于含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)液中，在 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 24 小時(shí)換液一次。待細(xì)胞匯合度達(dá) 80% 時(shí)進(jìn)行傳代，目前已連續(xù)傳代超過(guò) 100 代，細(xì)胞活力仍保持在 90% 以上，顯著優(yōu)于原代細(xì)胞（傳代 15 代后活力降至 50% 以下）。
該細(xì)胞系保留典型的不規(guī)則星形形態(tài)，胞體伸展呈多角狀，胞質(zhì)突起豐富且相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核呈圓形居中，核仁清晰可見(jiàn)。與原代 LSC 細(xì)胞相比，永生化細(xì)胞體積略大，增殖速率提高約 30%，群體倍增時(shí)間縮短至 60 小時(shí)。核型分析顯示，傳代 100 代后仍保持羔羊正常染色體數(shù)目，hTERT 基因穩(wěn)定整合于基因組中，端粒長(zhǎng)度維持在 5-8kb（原代細(xì)胞傳代 15 代后端粒縮短至 2kb 以下）。免疫熒光檢測(cè)證實(shí)，細(xì)胞高表達(dá)波形蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等支持細(xì)胞特異性標(biāo)志物，且表達(dá)水平與原代細(xì)胞無(wú)顯著差異，表明永生化過(guò)程未改變其細(xì)胞屬性。
在功能特性方面，hTERT-LSC 細(xì)胞系展現(xiàn)出更穩(wěn)定的生殖支持功能。ELISA 檢測(cè)顯示，其分泌的雄激素結(jié)合蛋白（ABP）濃度穩(wěn)定在 28ng/mL，顯著高于傳代后期的原代細(xì)胞（12ng/mL），且連續(xù)傳代 50 代后分泌能力無(wú)明顯下降。與精原細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)胞系可使精原細(xì)胞存活率提高 45%，促進(jìn)其向初級(jí)精母細(xì)胞分化的比例達(dá) 30%，效果優(yōu)于原代細(xì)胞且重復(fù)性更高。在永生化機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中 PI3K/Akt 信號(hào)通路持續(xù)激活，p53 抑癌基因表達(dá)受到適度抑制，為解析支持細(xì)胞永生化的分子網(wǎng)絡(luò)提供了直接證據(jù)。此外，該細(xì)胞系對(duì)生殖系統(tǒng)病原體如布魯氏菌的敏感性與原代細(xì)胞一致，感染后 24 小時(shí)即可觀察到典型的細(xì)胞病變，適合用于長(zhǎng)期感染模型的建立。
hTERT-LSC 細(xì)胞系在多個(gè)研究領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)te優(yōu)勢(shì)。在生殖發(fā)育研究中，通過(guò)連續(xù)傳代觀察，首ci揭示了羔羊支持細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中類(lèi)固醇合成酶的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律；在永生化機(jī)制研究中，利用該細(xì)胞系驗(yàn)證了端粒酶與端粒結(jié)合蛋白 TRF2 的協(xié)同調(diào)控作用；在應(yīng)用層面，已成功用于綿羊病毒性睪丸炎的藥物篩選，篩選出 3 種具有顯著保護(hù)效果的化合物。該細(xì)胞系的建立還為其他反芻動(dòng)物支持細(xì)胞的永生化提供了標(biāo)準(zhǔn)化方案，目前已據(jù)此建立了牛、山羊的同源永生化細(xì)胞系。
作為首ge穩(wěn)定傳代超過(guò) 100 代的羔羊睪丸支持細(xì)胞模型，hTERT-LSC 不僅解決了原代細(xì)胞研究的局限性，更開(kāi)創(chuàng)了反芻動(dòng)物生殖細(xì)胞長(zhǎng)期體外模擬的新范式。其在保持細(xì)胞原有功能特性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)永生化的特點(diǎn)，為生殖生物學(xué)基礎(chǔ)研究、動(dòng)物繁育技術(shù)創(chuàng)新及男性生殖疾病模型建立提供了跨物種的研究工具，對(duì)推動(dòng)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人類(lèi)生殖健康研究具有重要的雙向意義。
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