LⅡ小鼠網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤瘤株細(xì)胞系
LⅡ小鼠網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤瘤株細(xì)胞系源自 615 近交系小鼠的自發(fā)性網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤，是保留網(wǎng)織細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化特征和淋巴造血組織浸潤能力的惡性腫瘤模型，在網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤的發(fā)病機(jī)制、免疫逃逸及抗腫瘤藥物篩選研究中具有重要價(jià)值，為解析這種淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤的生物學(xué)行為提供了理想工具。
該細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤細(xì)胞形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形，以懸浮生長為主，部分細(xì)胞呈松散聚集狀態(tài)，細(xì)胞體積較大（直徑 15-25μm），核質(zhì)比ji高，細(xì)胞核呈圓形或腎形，染色質(zhì)呈疏松網(wǎng)狀，可見 1-3 個(gè)明顯核仁，核分裂象極為活躍（每 10 個(gè)高倍視野 15-20 個(gè)），胞質(zhì)豐富，呈嗜堿性，可見偽足樣突起，電鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的核糖體和少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞表面有較多微絨毛，符合網(wǎng)織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。免疫表型分析顯示，細(xì)胞高表達(dá)網(wǎng)織細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物 CD11b 和 Mac-1，流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性率分別達(dá) 90% 和 85%，同時(shí)表達(dá)單核巨噬細(xì)胞相關(guān)抗原 F4/80，陽性率達(dá) 75%，而 T、B 淋巴細(xì)胞標(biāo)志物 CD3、CD19 呈陰性，證實(shí)其網(wǎng)織細(xì)胞來源特性。
體外培養(yǎng)體系中，LⅡ 細(xì)胞展現(xiàn)出旺盛的增殖能力與強(qiáng)侵襲潛能。最適培養(yǎng)條件為含 15% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，添加 2mM 谷an酰胺，在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 48 小時(shí)，對數(shù)生長期細(xì)胞活力達(dá) 95% 以上，倍增時(shí)間約 24 小時(shí)，顯著快于正常網(wǎng)織細(xì)胞。其顯著特點(diǎn)是體外侵襲能力ji強(qiáng)，Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)中 24 小時(shí)穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)是正常網(wǎng)織細(xì)胞的 8 倍，這種侵襲能力與其高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶 - 12（MMP-12）密切相關(guān)，酶譜分析顯示其活性較正常網(wǎng)織細(xì)胞高 6 倍，可高效降解淋巴組織的基質(zhì)成分。軟瓊脂克隆形成率達(dá) 40%，克隆形態(tài)呈圓形或不規(guī)則形，邊緣模糊，反映其高度惡性的克隆形成能力。凍存復(fù)蘇性能優(yōu)異，液氮凍存后復(fù)蘇存活率超 90%，連續(xù)傳代 50 次后，CD11b 表達(dá)及侵襲能力無明顯衰減，保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。
LⅡ 細(xì)胞的核心價(jià)值體現(xiàn)在其對網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤浸潤淋巴造血組織過程的精準(zhǔn)模擬。在動物模型中，將 1×10?個(gè)細(xì)胞尾靜脈注射 615 小鼠，7 天即可在脾臟和淋巴結(jié)中檢測到腫瘤細(xì)胞，14 天脾臟和淋巴結(jié)明顯腫大（重量分別增加 4 倍和 3 倍），21 天骨髓浸潤率達(dá) 100%，病理切片顯示脾臟紅髓和白髓結(jié)構(gòu)被腫瘤細(xì)胞破壞，淋巴結(jié)濾泡消失，骨髓造血組織被大量腫瘤細(xì)胞取代，與人類網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤的淋巴造血組織浸潤模式高度一致。通過熒光標(biāo)記追蹤發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞首先定植于脾臟紅髓血竇和淋巴結(jié)邊緣竇，通過高表達(dá) L - 選擇素與淋巴組織血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而浸潤淋巴實(shí)質(zhì)，這種浸潤路徑依賴 CCR5-CCL5 趨化軸，CCR5 拮抗劑處理可使脾臟和淋巴結(jié)浸潤率下降 60%。
在發(fā)病機(jī)制研究中，該細(xì)胞系揭示了網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤te有的分子異常。基因測序顯示，細(xì)胞存在 NRAS 基因第 61 密碼子突變，導(dǎo)致 RAS/RAF/MEK 通路持續(xù)激活，Western blot 檢測顯示磷酸化 MEK（p-MEK）和磷酸化 ERK（p-ERK）表達(dá)量較正常網(wǎng)織細(xì)胞高 8 倍和 10 倍，使用 MEK 抑制劑處理后，細(xì)胞增殖率下降 65%，凋亡率上升 40%，證實(shí) NRAS 突變是其惡性增殖的重要驅(qū)動因素。此外，細(xì)胞中 NF-κB 信號通路異常激活，p65 亞基核轉(zhuǎn)位增加，可結(jié)合至 IL-6 啟動子區(qū)域，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，NF-κB 抑制劑處理可使細(xì)胞 G1 期比例增加 35%。
在轉(zhuǎn)移機(jī)制研究中，LⅡ 細(xì)胞展現(xiàn)出廣泛的淋巴造血組織轉(zhuǎn)移特性。動物實(shí)驗(yàn)顯示，除脾臟、淋巴結(jié)和骨髓外，肝臟和肺臟也可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，30 天肝轉(zhuǎn)移率達(dá) 50%，肺轉(zhuǎn)移率達(dá) 35%，這種多器官轉(zhuǎn)移特性與細(xì)胞高表達(dá)黏附分子 CD44v6 相關(guān)，該分子可與多種組織中的透明質(zhì)酸結(jié)合，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示其與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率達(dá) 45%，CD44v6 抗體處理可使肝轉(zhuǎn)移率下降 55%。體外遷移實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞對不同組織來源的趨化因子均有較強(qiáng)反應(yīng)，遷移能力是其他肉瘤細(xì)胞系的 2 倍，這種廣泛遷移能力與其高表達(dá)多種趨化因子受體相關(guān)。
在藥物篩選應(yīng)用中，LⅡ 細(xì)胞是評估網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤治療藥物的有效工具。體外藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞對蒽環(huán)類藥物敏感，阿mei素的 IC50 約 0.2μM，藥物處理后細(xì)胞周期停滯于 G2/M 期，凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3 活性上調(diào) 5 倍。聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)，阿mei素與 MEK 抑制劑聯(lián)用可使殺傷率提升至 85%，較單藥治療提高 35%，且對正常網(wǎng)織細(xì)胞毒性更低（IC50 提高 2.5 倍）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，阿mei素腹腔注射可使 615 小鼠脾臟重量減少 60%，外周血腫瘤細(xì)胞比例從 60% 降至 20%，證實(shí)其體內(nèi)抗網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤活性。
在免疫逃逸機(jī)制研究中，LⅡ 細(xì)胞通過多種方式逃避宿主免疫攻擊。細(xì)胞表面高表達(dá) PD-L1，較正常網(wǎng)織細(xì)胞高 5 倍，可與 T 細(xì)胞表面 PD-1 結(jié)合抑制免疫應(yīng)答，PD-L1 抗體處理可使腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的敏感性提高 40%。同時(shí)，細(xì)胞分泌大量 IL-10，可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）分化，使腫瘤微環(huán)境中 Treg 比例增加 3 倍，IL-10 中和抗體可增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。
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