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TECHNICAL ARTICLES
詳細介紹
來源與適應機制
形態與生長特征
功能特性
病毒敏感性:保留對冠狀病毒的高易感性,感染 SARS-CoV-2 后 48 小時病毒滴度達 10? TCID??/mL,與貼壁 Vero E6 細胞相當;對中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)、寨卡病毒等也具有敏感性,滴度較貼壁培養提升 10%-15%。
受體表達:血管緊張素轉換酶 2(ACE2)表達量達 9×10?分子 / 細胞(流式檢測),與貼壁細胞無顯著差異,為冠狀病毒入侵提供充足受體。
代謝特性:葡萄糖消耗速率為 25 mg/10? cells / 天,乳酸積累量較貼壁細胞降低 25%,更適合高密度長時間培養。
冠狀病毒疫苗生產
滅活疫苗規模化生產:在 1000L 攪拌式生物反應器中,Vero E6-S 細胞密度達 3×10? cells/mL,SARS-CoV-2 病毒滴度穩定在 10?.? TCID??/mL,單批次病毒產量達 3×1011 TCID??,可生產 3000 萬劑滅活疫苗,較轉瓶工藝效率提升 15 倍,生產成本降低 50%。疫苗中宿主細胞蛋白殘留量<30ng / 劑,符合 WHO 標準。
病毒樣顆粒(VLP)表達:作為重組桿狀病毒的宿主細胞,可高效表達冠狀病毒 S 蛋白 VLP,產量達 5μg/10? cells,純度超 90%,免疫小鼠后中和抗體效價達 1:1280,為亞單位疫苗研發提供低成本生產平臺。
病毒學研究與藥物篩選
病毒復制動力學研究:利用懸浮培養的均一性,精準測定 SARS-CoV-2 復制參數:潛伏期 8-10 小時,對數期 12-24 小時,平臺期 24-48 小時,為優化疫苗生產工藝提供數據支撐。
高通量藥物篩選:在 96 孔懸浮培養板中,可同時檢測 200 種以上化合物的抗病毒活性,篩選效率較貼壁培養提升 4 倍。例如,通過該模型篩選出的 3CL 蛋白酶抑制劑,對 SARS-CoV-2 的 EC??=1.2μM,與動物實驗結果一致性達 0.90。
診斷試劑研發
抗原制備:大量培養的病毒可用于制備冠狀病毒診斷抗原,如 S 蛋白與 N 蛋白,ELISA 試劑盒敏感性達 98%,特異性>99%,較傳統貼壁培養抗原批間差異降低 60%。
中和抗體檢測:作為病毒中和實驗的標準細胞,其懸浮培養的均一性使檢測變異系數<5%,結果穩定性顯著優于貼壁細胞,已被納入多個國家的新guan疫苗臨床評價標準。
基礎培養方案
培養基:無血清 SFM 培養基添加 4mM 谷an酰胺、0.1% Pluronic F-68,pH 維持在 7.2-7.4,每日監測溶氧(維持 30%-50%)與葡萄糖濃度(>1.5g/L)。
傳代流程:取對數期細胞懸液,1200rpm 離心 5 分鐘,棄上清后用新鮮培養基重懸,按初始密度 8×10? cells/mL 接種至搖瓶(轉速 110rpm),避免細胞團過大(>200μm)導致營養不均。
凍存保護:取密度 2×10? cells/mL 的細胞,加入含 10% DMSO 的凍存液(SFM 培養基配制),程序降溫后液氮保存,復蘇時 37℃水浴解凍,直接接種至預熱培養基(無需離心洗滌)。
病毒培養與放大
冠狀病毒接種:細胞密度達 2×10? cells/mL 時,按 MOI=0.05 加入病毒液,37℃培養,感染后 24 小時補加 50% 體積新鮮培養基,48-72 小時收獲病毒液,通過 0.45μm 濾膜澄清。
生物反應器控制:采用 pH-stat 補料策略,當 pH>7.3 時補加葡萄糖溶液(500g/L),維持代謝穩定,可延長病毒復制期 12 小時,滴度提升 20%。
優勢:
規模化生產能力:懸浮培養可通過生物反應器實現大規模擴增,單批次產量滿足千wan級疫苗需求,適合突發疫情應急生產。
工藝穩定性:細胞生長與病毒復制均一性高,批間差異<8%,便于質量控制與工藝驗證。
成本效益:較貼壁培養減少 90% 的培養面積需求,人力成本降低 60%,適合工業化大生產。
局限性:
培養基成本:無血清 SFM 培養基價格為傳統培養基的 4 倍,初期投入較高。
技術門檻:需掌握懸浮細胞計數、反應器參數調控等技能,對操作人員要求嚴格。
病毒譜局限:主要適用于冠狀病毒等少數病毒,對其他病毒支持能力有限。
Vero E6-S 懸浮適應株的建立推動了冠狀病毒疫苗生產技術的革新,其在新guan疫苗研發中的應用,使全qiu首支滅活疫苗快速實現規模化供應,為疫情防控提供關鍵支撐。技術層面,其馴化策略為其他貼壁細胞的懸浮改造提供了范式,已成功應用于 MDCK、HEK293 等細胞系。未來,通過基因編輯過表達 ACE2 與 TMPRSS2,有望進一步提升病毒產量;結合連續灌流培養技術,可實現病毒的連續生產,推動疫苗生產向智能化、高效化發展。
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